Applicazione di un nuovo test ELISA indiretto per la ricerca di anticorpi totali verso il virus delle rinotracheite infettiva bovina su pools di sieri

Summary To date, Infectious Bovine Rhinotracheitis, caused by Bovine Herpesvirus 1(BoHV1), represents an unsolved problem in livestock in terms of animal health and economic losses. Since 2004 Piedmont adopted a voluntary control and eradication plan, which has been modified in 2008 because of the reduction of economic resources. Currently, even if an annual individual serological investigation is carried out in IBR free and IBR marker vaccinated farms, the most positive farms (prevalence higher than 10%) are not tested. The reduction of costs for IBR surveillance in gE negative herds could make available more regional funds to test positive farms. The aim of this study is to evaluate the applicability of a new indirect ELISA test to detect antibodies against whole virus in pooled sera of IBR free farms. A panel of 358 pools, made by 2864 sera, was tested. New indirect ELISA scores high sensitivity (96.7%) and specificity (100%) thus setting the stage for a more extensive validation study. Introduzione La Rinotracheite infettiva bovina (IBR), è una malattia a grave impatto economico e sanitario, inserita nella lista OIE e che in Piemonte è oggetto di un piano volontario di eradicazione a partire dal 2004 (6, 3,4). Negli ultimi anni, a causa delle sempre più limitate risorse economiche, il Piano ha subito un forte ridimensionamento e una drastica riduzione del numero di esami, concentrando i test per la sorveglianza in aziende indenni ed ufficialmente indenni (2). In allevamenti negativi per anticorpi totali il controllo sierologico individuale viene effettuato una volta all’anno su tutti i capi bovini di età superiore ai 24 mesi. In tali aziende, la possibilità di effettuare una sorveglianza mediante utilizzo di pool di sieri permetterebbe una concentrazione di fondi e quindi un potenziamento dell’iter diagnostico sulle aziende infette (gE positive) per le quali è previsto un monitoraggio sierologico solo su 10 soggetti giovani. Il test ELISA su pools di sieri rappresenterebbe un approccio diagnostico poco costoso per valutare la presenza di animali infetti in azienda (5). Uno studio irlandese, che impiegava un test commerciale per la ricerca di anticorpi contro il BoHV1 intero ha dimostrato come, applicando un cut off tarato sulla base delle dimensioni del pool, parametri come sensibilità e specificità siano idonei alla sorveglianza (1). L’obiettivo del presente studio è valutare l’applicabilità di un nuovo test ELISA indiretto per anticorpi totali contro il BoHV1 su pools di otto sieri individuali. Materiali e metodi Un totale di 358 pools, costituiti da 2864 sieri sono stati testati mediante un nuovo test ELISA indiretto per anticorpi totali. I sieri provenivano da allevamenti della provincia di Torino con diverso status sanitario nei confronti dell’IBR (ufficialmente indenne, indenne, vaccinata deleto, positiva) e già testati in diagnostica ufficiale. Il protocollo ELISA ha previsto un’incubazione primaria di 60’ a temperatura ambiente di 10μl di ciascun pool diluito 1/20 nel tampone di diluizione del primario (PBS Caseina 1,25%). Dopo la fase di lavaggio, le piastre sono state incubate per 45’ con un anticorpo secondario marcato con perossidasi. Dopo l’aggiunta del substrato (TMB) e 15’ di sviluppo, la reazione è stata letta allo spettrofotometro con filtro a 450 nm. Il cut-off di reattività è definito come il 100% rispetto al controllo positivo in piastra. I risultati del nuovo test sono stati confrontati con gli esiti ufficiali di ciascun siero individuale ed è stata fatta una valutazione preliminare di sensibilità e specificità del metodo. Risultati e discussione Su 358 pools testati (Tabella 1), contenenti sieri positivi al test ufficiale in numero variabile (da 0 a 8), 354 sono stati correttamente classificati (Figura 1). Su un totale di 121 pools, contenenti almeno un siero positivo, 117 hanno dato una reattività in ELISA al di sopra del cut-off, mentre i restanti 4, sebbene ripetuti, hanno dato sempre esito negativo al test (sensibilità del 96.7% ; 95% CI 91.7-99.1%). I 4 pools, ritenuti critici, contenevano un unico siero debolmente positivo al test individuale. Tutti i pools costituiti unicamente da sieri negativi per anticorpi totali (237) sono risultati negativi in ELISA, mostrando una specificità del test pari al 100% (95%CI 98.5-100%). Sulla base dei dati raccolti, il test dimostra ottime potenzialità nell’applicazione in diagnostica ufficiale per la sorveglianza in aziende ufficialmente indenni. Va sottolineato come l’effetto di diluizione renda più difficile la restituzione di esiti falsi positivi su pools rispetto alla prova su siero individuale (1). A dimostrazione di ciò, un siero con reattività al test ufficiale pari al 44% (cut-off del test ufficiale: ≥ 25%), negativo al test gB ELISA per la conferma di positività, ha rivelato un esito nettamente al di sotto del cut-off al nostro test ELISA, quando diluito in altri 7 sieri negativi. Inoltre, la presenza di sieri deboli positivi in pools di aziende ufficialmente indenni è altamente improbabile considerando l’epidemiologia della malattia, le caratteristiche biologiche del virus e la rapida e totale cinetica di sieroconversione in una popolazione immunologicamente negativa. A favorire l’applicabilità del test in esame nella diagnostica di routine sarebbe inoltre la rapidità del protocollo, che prevede un’incubazione primaria di 60’ a temperatura ambiente rispetto a quella overnight a 4oC di altri kit commerciali. Presso alcuni laboratori diagnostici i sieri sono stoccati su micropiastre e trasferiti su una piastra per la ricerca di anticorpi totali contro il virus, secondo un analogo schema. Sfruttando questo sistema di stoccaggio i pools possono essere allestiti utilizzando vaschette di plastica per reagenti a 8 canali, favorendo così anche la manualità dell’operatore. In un’ottica di razionalizzazione delle risorse, testando sulla stessa piastra aziende ufficialmente indenni, si ridurrebbe il numero di test eseguiti. In caso di positività di un pool, si potrebbe eseguire, il giorno seguente, il test individuale, consentendo così l’identificazione degli animali positivi. In futuro sarà necessario raccogliere un maggior numero di campioni per una più robusta validazione. Allo stesso tempo sarà tarato il cut-off del test al fine di identificare un singolo positivo in un pool di 16 sieri, razionalizzando così ulteriormente le risorse senza compromettere la sensibilità e la specificità del metodo.