ADESIONE E VITALITÀ DELLE CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI (MSC) MESSE IN COLTURA SU MICROSFERE POLIMERICHE

INTRODUZIONE E’ noto che gran parte delle cellule staminali iniettate nel miocardio ischemico va incontro ad apoptosi e necrosi a causa di fattori presenti nel tessuto ischemico. Lo scopo di questo studio è quello di valutare l’andamento temporale dell’adesione e della vitalità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) esprimente la proteina fluorescente verde (GFP+) messe in coltura su microsfere polimeriche. Dopo un opportuno studio in vitro si procederà all’iniezione di complessi cellule-microsfere per valutare le modalità più efficaci, l’attecchimento e la sopravvivenza di queste cellule dopo impianto nel cuore infartuato. MATERIALI E METODI ISOLAMENTO DELLE CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI Le cellule staminali sono state estratte dal midollo osseo di femori di ratti Wistar di 6-12 mesi di età (peso 450-550g) stabilmente transfettati con il gene della proteina fluorescente verde sotto il controllo del promoter della β-actina. Questo tipo di ratti è stato scelto affinché dopo l’impianto nel miocardio la colorazione verde permetta il facile riconoscimento delle cellule staminali al microscopio confocale. Dopo lavaggio del canale midollare con una soluzione di terreno -MEM al 20% di siero fetale bovino (FBS), la sospensione cellulare è stata filtrata e messa in coltura a 37°C. Trascorse 24 ore il terreno è stato sostituito con -MEM al 10% di FBS (1-2). Le cellule sono state identificate mediante protocolli di immunocitochimica. Le MSC venivano quindi fatte crescere in passaggi successivi di coltura fino al raggiungimento del passaggio 3 (P3), sostituendo il mezzo ogni 2-3 giorni. Preparazione delle cellule ai fini sperimentali: Il giorno dell’esperimento le MSC sono state staccate con tripsina-EDTA, contate e risospese secondo le condizioni sperimentali riportate in seguito. MICROSFERE: “pharmacologically active carriers”(PAM) Le PAM sono costituite da un copolimero formato dal 37,5% di acido D-lattico, dal 37.5% di acido L-lattico e dal 25% di acido glicolico (PLGA 37.5/25, PM 30.000 Da). La superficie di queste microsfere è inoltre ricoperta di fibronectina e polilisina al fine di far aderire le MSC. Tali microsfere sono state fornite dalla Prof.ssa C. N. Montero-Menei (Laboratoire d’Ingènierie de la Vectorisation Particulaire, Universitè d’Angers, Angers, France, EU). Le microsfere sono state conservate a +4°C in un essiccatore al fine di mantenere la disidratazione. Il giorno dell’esperimento le microsfere sono state risospese nel mezzo di coltura impiegato per il mantenimento delle MSC, mediante il seguente protocollo: le PAM sono state preparate seguendo le indicazioni fornite dalla Prof.ssa Montero-Menei. Le microsfere sono state in parte mantenute ai fini della valutazione sperimentale, con e senza solvente (acqua 94.3%, CMCNa 0.94%, Mannitolo 3.7%, Polisorbato 80 0.94%) diluito con il terreno di coltura nei rapporti 1:5 oppure 1:10. Il solvente ha la proprietà di ridurre l’adesione tra le PAM per cui il suo utilizzo è stato suggerito per l’impianto delle cellule nel cuore. Gruppi sperimentali: Sono stati presi in considerazione 8 gruppi sperimentali. Inizialmente sono stati considerati i seguenti gruppi: 1) (2x104) MSC-GFP+ + terreno 2) (2x104) MSC-GFP+ + solvente (diluito 1:5) 3) (2x104) MSC-GFP+ + solvente (diluito 1:5) + PAM Successivamente, per valutare se il solvente potesse interferire con l’adesione tra cellule e PAM è stata confrontata l’adesione con e senza solvente a maggiore diluizione: 4) (2x104) MSC-GFP+ + terreno + PAM 5) (2x104) MSC-GFP+ + solvente (diluito 1:10) + PAM Infine per valutare se la quantità di cellule messe a incubare con le PAM potesse influenzare l’adesione, è stato ripetuto l’esperimento raddoppiando la quantità di MSC-GFP+ piastrate nelle seguenti condizioni sperimentali: 6) (4x104) MSC-GFP+ + terreno 7) (4x104) MSC-GFP+ + terreno + PAM 8) (4x104) MSC-GFP+ + solvente (diluito 1:10) + PAM L’adesione delle MSC alle microsfere è stata valutata dopo 24 ore con microscopia ottica. Al fine di facilitare l’identificazione delle cellule è stata impiegata la colorazione del blu di toluidina. Le cellule sono state pertanto messe in incubazione con il colorante per 10 min. Per valutare l’andamento temporale dell’adesione, si sono mantenute le MSC in presenza delle PAM a 48 e 72 ore. La vitalità delle cellule insieme alle microsfere è stata stimata a 48h con [-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (MTT) mediante spettrofotometro in modo da valutare se venisse influenzata dall’adesione alle microsfere o dalla presenza del solo solvente (1:5). Le misure di vitalità sono quindi state eseguite nei gruppi sperimentali 1), 2) e 3). Dopo incubazione di 24h nella piastra a bassa adesione le cellule sono state trasferite in una piastra normale da coltura e lasciate per altre 24h in incubatore per permetterne l’adesione alla piastra per la durata necessaria alla metabolizzazione dell’MTT (diluito 1:10 nel terreno di coltura). RISULTATI • ADESIONE CELLULARE: Dopo 24h di incubazione nella piastra a bassa adesione i campioni sono stati fissati ed osservati al microscopio ottico. Dalle immagini ottenute è stato possibile osservare che le MSC piastrate in presenza del solo solvente non presentavano alterazioni morfologiche rispetto alle MSC da sole. Le MSC incubate con le PAM in presenza di solvente hanno inoltre formato agglomerati di differenti dimensioni. L’osservazione ha evidenziato inoltre che le microsfere fornite hanno una dimensione compresa in un range molto ampio (da 2 a 90 m di diametro) ma solamente le PAM di dimensioni maggiori sembrano avere la capacità di permettere l’adesione delle cellule. Alcune delle microsfere più piccole rimangono inglobate nei grossi aggregati formati da cellule e microsfere di maggiori dimensioni, ma nella maggior parte dei casi rimangono libere o formano catenelle tra loro. Inoltre le cellule adese alle PAM non assumono una forma distesa come quando aderiscono alla piastra, ma tendono a rimanere rotonde limitando quindi la superficie a contatto con le microsfere. In assenza di solvente è stata osservata una maggiore percentuale delle MSC adese alle PAM con conseguente formazione di aggregati di maggiori dimensioni rispetto alle MSC in presenza di solvente. La presenza del solvente, diluito sia a 1:5 che a 1:10, ha fatto diminuire la dimensione degli aggregati e ha fatto aumentare il numero di miscrosfere “nude”, dimostrando che il solvente non solo riduceva l’aggregazione tra le microsfere ma interferiva anche sulla capacità di adesione delle MSC alle microsfere. Raddoppiando la quantità di MSC (4x104), in totale assenza del solvente, le cellule sono state in grado di formare con le PAM aggregati più grandi rispetto a quelli precedentemente osservati (2x104). Raddoppiando la quantità di MSC (4x104), in presenza del solvente, si ottengono degli aggregati di dimensioni minori se confrontati con quelli ottenuti in assenza di solvente. Nonostante ciò la presenza di un maggior numero di cellule favorisce l’adesione alle PAM e quindi la formazione di aggregati più grandi. L’incubazione a tempi prolungati (48 e 72h) delle MSC con le PAM, in assenza del solvente, ha evidenziato che queste cellule sono in grado di formare aggregati più grandi rispetto a quelli osservati in precedenza. E’ stato infine provato il passaggio di cellule + PAM attraverso una siringa con ago 22G, è stato visto che si determina il parziale distacco delle cellule in precedenza adese, suggerendo quindi un legame molto debole tra cellula e PAM dovuto alla limitata area di adesione delle MSC che mantengono la forma sferica. • VITALITA’ CELLULARE: I risultati ottenuti con il metodo MTT hanno evidenziato che non ci sono differenze nella vitalità cellulare in tutte e tre le condizioni di coltura considerate, indicando che sia la soluzione che le PAM non alterano la vitalità delle MSC. CONCLUSIONI Dai risultati così ottenuti si può concludere che la composizione sia delle microsfere che del solvente non alterano la morfologia e la vitalità delle MSC. Le MSC sono state in grado, nell’arco di 24h, di formare aggregati di grosse dimensioni solo in totale assenza del solvente. A differenza di quanto riportato in letteratura su altri modelli cellulari (3) alla luce dei nostri risultati si può affermare che le MSC-GFP+ non aderiscano facilmente alle microsfere. Infatti, l’osservazione al microscopio ottico ha evidenziato che le cellule non assumono una forma distesa come quando aderiscono sulla piastra, ma tendono a rimanere rotonde. Sia aumentando la quantità di cellule (da 2x104 a 4x104) che i tempi di incubazione (48 e 72h) il numero delle cellule adese alle microsfere aumenta determinando però la formazione di aggregati di grosse dimensioni difficilmente utilizzabili in una successiva fase di impianto. Esistono inoltre difficoltà all’iniezione nei cuori infartuati dei complessi cellule-microsfere. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1) Raimondo et al., J Anat. 2006 Jan;208(1):3-12. 2) Gallo et al., J Cell Biochem. 2007 Jan 1;100(1):86-99. 3) Tatard et al., Biomaterials 2007 Jan 4;28:1978-1988.