Messa a punto del metodo di estrazione e determinazione analitica, tramite HPLC, dell'amfotericina B su campioni ematici

In Italia, sono disponibili due formulazioni lipidiche di amfotericina B (AMFB): associata a complessi lipidici (Abelcet) e liposomiale (Ambisome). Queste presentano differenze peculiari importanti come stabilità e distribuzione tissutale. La farmacocinetica dell’AMFB nella pratica clinica, nonostante sia un elemento importante per la scelta della formulazione ottimale da utilizzare in ogni singolo caso, rimane poco studiata. Scopo di questo lavoro è quello di mettere a punto una metodica di estrazione e determinazione analitica dell’AMFB, da campioni di sangue intero di pazienti, per fornire un metodo di valutazione della farmacocinetica. L’AMFB viene estratta da campioni di 200 μl di sangue intero dopo precipitazione delle proteine tramite 200 μl di metanolo e 400 μl di dimetilsolfossido. L’analisi viene condotta tramite HPLC-UV su colonna C18 (LiChrospher®100 RP-18, 250-4, 5 μm, Waters) eluita in isocratica ad 1 ml/min con una miscela di acetonitrile e ammonio acetato 5mM (45:55). In queste condizioni il tempo di ritenzione dell’AMFB è di circa 7 minuti. L’assorbanza dell’eluato viene rilevata mediante un detector UV/VIS a λ=404 nm. Con questa metodica è stata costruita una retta di taratura in un range da 0,1 a 1 μg/ml. È stato condotto uno studio di stabilità e fotosensibilità in varie condizioni di conservazione. La messa a punto delle metodiche di estrazione dell’AMFB da sangue intero si è basata sul metodo descritto da R. Lopez-Galera. Dalle prove di stabilità si evince che l’AMFB rimane stabile per almeno 24 ore a temperatura ambiente anche se sottoposta a luce artificiale, mentre viene in minima parte degradata dopo conservazione di 10 giorni a 4°C, risultando invece stabile se conservata a -20°C. La retta di taratura risulta lineare nel range considerato, l’equazione è: y= 0,0553x + 0,5011, dove y rappresenta l’area del picco e x i ng di AMFB nei 200 μl di sangue estratto. Il coefficiente di regressione della retta è: R2= 0,9994. La minima concentrazione misurabile, 0,1 μg/ml, rende il metodo applicabile agli studi farmacocinetici in pazienti. Il metodo ha permesso di definire un protocollo efficace, semplice, rapido ed economico per l’estrazione e la determinazione analitica dei parametri farmacocinetici dell’AMFB. Dopo aver messo a punto il metodo per la determinazione dell’AMFB ematica, si potrà procedere con il reclutamento di pazienti, per poter confrontare la farmacocinetica delle due diverse forme farmaceutiche e definire linee guida utili per la scelta della formulazione più adatta alle diverse esigenze terapeutiche e profilattiche.