In questo studio sono stati sviluppati e confrontati cinque metodi di estrazione del DNA di zigomiceti. La parete dei funghi rende l’operazione della purificazione del DNA particolarmente difficoltosa ed e' per questo motivo che necessita di messa a punto e valutazione. Lo scopo del lavoro e' stato quello di ottenere un DNA di qualita' e quantita' sufficienti per la successiva amplificazione. Sono stati usati un ceppo di Rhizopus spp. e tre di Mucor spp.. Piastre di Sabouraud dextrose agar sono state inoculate con i funghi e incubate a 25 °C per 24-72 ore fino alla formazione del micelio. Una porzione del micelio di circa 10-20 mg e' stata prelevata e posta in una provetta Eppendorf con 600μl di soluzione fisiologica sterile e congelata a -20°C fino all’uso. Il materiale contenuto nelle provette e' stato omogenato tramite l’utilizzo di una siringa e processato con cinque differenti protocolli di estrazione. Il protocollo A ha previsto una lisi e una successiva bollitura prima della precipitazione; il protocollo B ha accoppiato alla lisi l’uso delle microonde; il protocollo C ha sfruttato il congelamento e scongelamento lento; il protocollo D ha sfruttato l’uso del b-mercaptoetanolo come riducente delle proteine contenute nel campione; il protocollo E ha sfruttato un tampone a base di acetato di potassio e acido acetico, dopo la lisi, al fine di favorire la precipitazione di grosse molecole derivanti dalla rottura della parete fungina. I protocolli C e D hanno utilizzato un buffer con il 3% di detergenti (1% SDS e 2% Triton x-100 il protocollo C e 3% SDS il protocollo D). Al fine di quantificare il DNA estratto per fini amplificativi e' stata messa a punto una real time PCR quantitativa duplex. I protocolli migliori sono risultati il C e D che hanno determinato rese paragonabili. In particolare il protocollo C e' risultato il migliore per Rhizopus spp., mentre il protocollo D per i tre ceppi di Mucor spp.. Nel dettaglio il protocollo C per Rhizopus spp. ha dato risultati migliori del 32% rispetto al D e del 92-93% rispetto agli altri, mentre per i ceppi di Mucor spp. il protocollo D ha evidenziato risultati migliori del 18% rispetto al C, del 35% rispetto all’A e oltre l’87% rispetto a tutti gli altri. In conclusione, si puo' affermare che i protocolli C e D si sono rivelati i migliori per l’estrazione di DNA amplificabile da zigomiceti: l’uso dei detergenti in questi protocolli testimonia che per i funghi il passaggio fondamentale risulta essere dunque la rottura della parete.
CONFRONTO DI METODI PER L’ISOLAMENTO DI DNA DA ZIGOMICETI
BERGALLO, Massimiliano;BANCHE, Giuliana;MONTANARI, Paola;TULLIO, Viviana Cristina;ROANA, Janira;MANDRAS, Narcisa;SCALAS, Daniela;ALLIZOND, VALERIA;MANETTA, Tilde;TOVO, Pier Angelo;CUFFINI, Annamaria
2013-01-01
Abstract
In questo studio sono stati sviluppati e confrontati cinque metodi di estrazione del DNA di zigomiceti. La parete dei funghi rende l’operazione della purificazione del DNA particolarmente difficoltosa ed e' per questo motivo che necessita di messa a punto e valutazione. Lo scopo del lavoro e' stato quello di ottenere un DNA di qualita' e quantita' sufficienti per la successiva amplificazione. Sono stati usati un ceppo di Rhizopus spp. e tre di Mucor spp.. Piastre di Sabouraud dextrose agar sono state inoculate con i funghi e incubate a 25 °C per 24-72 ore fino alla formazione del micelio. Una porzione del micelio di circa 10-20 mg e' stata prelevata e posta in una provetta Eppendorf con 600μl di soluzione fisiologica sterile e congelata a -20°C fino all’uso. Il materiale contenuto nelle provette e' stato omogenato tramite l’utilizzo di una siringa e processato con cinque differenti protocolli di estrazione. Il protocollo A ha previsto una lisi e una successiva bollitura prima della precipitazione; il protocollo B ha accoppiato alla lisi l’uso delle microonde; il protocollo C ha sfruttato il congelamento e scongelamento lento; il protocollo D ha sfruttato l’uso del b-mercaptoetanolo come riducente delle proteine contenute nel campione; il protocollo E ha sfruttato un tampone a base di acetato di potassio e acido acetico, dopo la lisi, al fine di favorire la precipitazione di grosse molecole derivanti dalla rottura della parete fungina. I protocolli C e D hanno utilizzato un buffer con il 3% di detergenti (1% SDS e 2% Triton x-100 il protocollo C e 3% SDS il protocollo D). Al fine di quantificare il DNA estratto per fini amplificativi e' stata messa a punto una real time PCR quantitativa duplex. I protocolli migliori sono risultati il C e D che hanno determinato rese paragonabili. In particolare il protocollo C e' risultato il migliore per Rhizopus spp., mentre il protocollo D per i tre ceppi di Mucor spp.. Nel dettaglio il protocollo C per Rhizopus spp. ha dato risultati migliori del 32% rispetto al D e del 92-93% rispetto agli altri, mentre per i ceppi di Mucor spp. il protocollo D ha evidenziato risultati migliori del 18% rispetto al C, del 35% rispetto all’A e oltre l’87% rispetto a tutti gli altri. In conclusione, si puo' affermare che i protocolli C e D si sono rivelati i migliori per l’estrazione di DNA amplificabile da zigomiceti: l’uso dei detergenti in questi protocolli testimonia che per i funghi il passaggio fondamentale risulta essere dunque la rottura della parete.
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