Gli Organizzatori Nucleolari (NORs) corrispondono topograficamente alle regioni del nucleo attorno a cui i nucleoli si riorganizzano alla fine della telofase. Essi sono tratti di DNA che contengono i geni ribosomali e sono situati sul braccio corto dei 5 cromosomi acrocentrici. Ogni NOR comprende una quarantina di “loops” di DNA, ciascuno dei quali corrisponde ad un gene ribosomale o cistrone. Associate ai NORs vi sono alcune fosfoproteine, tra cui la nucleolina e la proteina B23, che hanno una elevata affinità per i sali di argento: queste sono le proteine AgNORs o, più brevemente, gli AgNORs. Un semplice metodo di impregnazione argentica, messo a punto da Ploton (1), ha permesso di evidenziare gli AgNORs anche in sezioni di tessuti fissati ed inclusi e ne ha reso disponibile l’analisi in istopatologia. Da una Medline eseguita via Internet, a tutt’oggi risultano pubblicati 1349 lavori scientifici comprendenti i termini “nucleolar organizer region and tumor”. Inizialmente venne segnalata una netta differenza di AgNORs tra lesioni melanocitarie benigne e maligne (2), e linfomi maligni di alto e basso grado, e si pensò di utilizzare il metodo soprattutto per fini diagnostici. Nelle lesioni benigne, infatti, gli AgNORs sono generalmente pochi e raggruppati in grossi “dots”, mentre in quelle maligne essi appaiono di solito più numerosi, piccoli e dispersi nel nucleo. Tuttavia le numerose sovrapposizioni del numero di AgNORs tra lesioni benigne e maligne rendono problematica l’applicazione pratica nel singolo caso, anche se in alcuni casi l’analisi degli AgNORs è di indubbio valore diagnostico, come nella distinzione tra nevi e melanomi, tra versamenti pleurici reattivi e neoplastici, tra fibromatosi e fibrosarcomi giovanili, e tra pielonefrite xantogranulomatosa e carcinomi renali. Noi abbiamo dimostrato una chiara differenza nel numero e distribuzione degli AgNORs tra nevo blu cellulare benigno e maligno. Ben presto emerse che l’analisi degli AgNORs aveva un forte potenziale prognostico. Dopo alcune osservazioni sul neuroblastoma infantile, studi su casistiche più ampie dimostrarono una chiara correlazione tra quantità di AgNORs e prognosi in carcinomi del grosso intestino. Da allora sono stati pubblicati 404 lavori sul significato prognostico degli AgNORs in tumori di ogni tipo istologico ed apparato. Nella maggior parte di essi è segnalata una correlazione tra elevata quantità di AgNORs e cattiva prognosi. Per più di 10 anni abbiamo studiato nel nostro laboratorio gli AgNORs in diversi tipi di neoplasie umane, e abbiamo potuto dimostrare un forte valore prognostico dell’analisi degli AgNORs in carcinomi della faringe, mielomi multipli, timomi, carcinomi della mammella maschile, carcinomi renali, carcinomi della prostata e in leucemie acute mieloidi dell’adulto. In tutte queste neoplasie, eccetto la leucemia mieloide acuta, l’analisi degli AgNORs appare come un fattore prognostico indipendente in analisi multivariata (3). Numerose sono le ragioni teoriche e sperimentali del valore prognostico degli AgNORs: esse sono sate discusse in ampie recensioni (4) e riassunte in una recente rassegna (3). Innanzi tutto, un aumento di AgNORs può dipendere da una aumentata richiesta di biogenesi ribosomale, il che riflette una elevata attività metabolica cellulare. Poi, essendo gli AgNORs localizzati nei cromosomi acrocentrici, un aumento di questi, che si può verificare in condizioni di aneuploidia, potrebbe tradursi in un aumento del numero di AgNORs. Noi abbiamo osservato una significativa associazione tra AgNORs e contenuto di DNA, valutato con citometria di flusso, in timomi, e in carcinomi vescicali e mammari maschili. Inoltre, è ben documentata l’associazione tra AgNORs e il grado di differenziazione istologica, uno dei classici parametri di prognosi tumorale. Questo è emerso anche in nostre ricerche nel mieloma multiplo, e in carcinomi vescicali, mammari maschili e prostatici. Soprattutto, la quantità di AgNORs riflette l’attività proliferativa cellulare. A conferma di molti lavori riportati in letteratura, noi abbiamo osservato una forte correlazione tra AgNORs ed indici di proliferazione, come il MIB-1 e PCNA in carcinomi mammari maschili, vescicali e faringei, e incorporazione di bromodesossisuridina nel mieloma multiplo. Tuttavia, la progressione neoplastica dipende, più che dall’attività proliferativa di per sé, dalla rapidità della proliferazione, ed è stato dimostrato che gli AgNORs sono strettamente correlati colla velocità di duplicazione cellulare. Infatti, la duplicazione cellulare richiede la sintesi di molte nuove proteine e quindi una attiva sintesi di RNA ribosomale, per la cui trascrizione sono necessarie le proteine AgNORs, soprattutto la nucleolina e la B23. Se il tempo di duplicazione cellulare è breve, la sintesi di RNA ribosomale in questo periodo deve essere necessariamente elevata, e grande è l’aumento di tutte le proteine nucleolari implicate nella trascrizione ed assemblaggio del RNA ribosomale. Pertanto un elevato numero di AgNORs indica che un tumore ha una elevata attività metabolica, ha probabilmente un contenuto anomalo di DNA, è verosimilmente poco differenziato, ha una elevata attività proliferativa ed una rapida crescita. Quindi una grande quantità di AgNORs è espressione di un fenotipo tumorale aggressivo. Oltre che informazioni sulla biologia tumorale, l’analisi degli AgNORs offre anche alcuni vantaggi di ordine pratico per il patologo. In primo luogo, può essere eseguita anche su biopsie molto piccole e difficilmente ripetibili, consentendo la contemporanea valutazione dell’attività proliferativa e dell’aspetto istologico, a differenza di altri metodi come la citometria di flusso che richiedono spesso l’esaurimento del materiale. Poi, permette di individuare nell’ambito di una neoplasia gruppi o foci di cellule con elevata attività proliferativa, localizzando cloni neoplastici particolarmente aggressivi. Inoltre, consente di valutare l’attività proliferativa delle sole cellule neoplastiche quando sono scarse e disperse tra altre cellule non tumorali altamente proliferanti, come nei timomi a prevalenza linfocitaria o nei mielomi interstiziali. Infine, combinando la valutazione della proliferazione e il grado di differenziazione istologica, permette al patologo di identificare gruppi di rischio morfo-funzionali. Proprio su queste basi, abbiamo potuto differenziare pazienti con mieloma, carcinomi della faringe, della mammella maschile e della prostata in gruppi di alto e basso rischio, che potrebbero beneficiare di diversi approcci terapeutici. Alcune perplessità ancora oggi ostacolano una diffusione più ampia dell’analisi degli AgNORs. Tra queste, una presunta indaginosità e, soprattutto, una scarsa riproducibilità del metodo. In realtà, esso non è più complesso di altre metodiche isto- e immunoistochimiche, e risultati riproducibili possono essere ottenuti ricorrendo all’analisi standardizzata (5), che prevede tempi e temperature di incubazione strettamente controllati e la misurazione dell’area degli AgNORs con analizzatore di immagine. Dal 1993, il Comitato Europeo per la Quantificazione degli AgNORs organizza incontri a scadenza annuale o biennale, per divulgare i risultati più recenti e proporre aggiornamenti e nuove applicazioni del metodo. E’ auspicabile che questa attività venga ulteriormente sviluppata inserendo questi incontri in apposite sessioni di Congressi scientifici nazionali ed internazionali. Bibliografia 1. Ploton D, Menager M, Jeannesson P, Himber G, Pigeon F, Adnet JJ. Improvement in the staining and in the visualisation of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level. Histochem J 18, 5-14, 1986. 2. Crocker J, Skilbeck N. Nucleolar organizer regions in melanocytic lesions: a quantitative study. J Clin Pathol 40, 885-889, 1987. 3. Pich A, Chiusa L, Margaria E. Prognostic relevance of AgNORs in tumor pathology. Micron 31, 133-141, 2000. 4. Derenzini M, Sirri V, Trerè D: Nucleolar organizer regions in tumor cells. Cancer J 7:71-77,1994. 5. Tuccari G, Giuffrè G, Öfner D, Rüschoff J. Standardized use of the AgNOR method. J Oral Pathol Med 29, 526-527, 2000.
Significato degli AgNORs in patologia tumorale.
PICH, Achille
2001-01-01
Abstract
Gli Organizzatori Nucleolari (NORs) corrispondono topograficamente alle regioni del nucleo attorno a cui i nucleoli si riorganizzano alla fine della telofase. Essi sono tratti di DNA che contengono i geni ribosomali e sono situati sul braccio corto dei 5 cromosomi acrocentrici. Ogni NOR comprende una quarantina di “loops” di DNA, ciascuno dei quali corrisponde ad un gene ribosomale o cistrone. Associate ai NORs vi sono alcune fosfoproteine, tra cui la nucleolina e la proteina B23, che hanno una elevata affinità per i sali di argento: queste sono le proteine AgNORs o, più brevemente, gli AgNORs. Un semplice metodo di impregnazione argentica, messo a punto da Ploton (1), ha permesso di evidenziare gli AgNORs anche in sezioni di tessuti fissati ed inclusi e ne ha reso disponibile l’analisi in istopatologia. Da una Medline eseguita via Internet, a tutt’oggi risultano pubblicati 1349 lavori scientifici comprendenti i termini “nucleolar organizer region and tumor”. Inizialmente venne segnalata una netta differenza di AgNORs tra lesioni melanocitarie benigne e maligne (2), e linfomi maligni di alto e basso grado, e si pensò di utilizzare il metodo soprattutto per fini diagnostici. Nelle lesioni benigne, infatti, gli AgNORs sono generalmente pochi e raggruppati in grossi “dots”, mentre in quelle maligne essi appaiono di solito più numerosi, piccoli e dispersi nel nucleo. Tuttavia le numerose sovrapposizioni del numero di AgNORs tra lesioni benigne e maligne rendono problematica l’applicazione pratica nel singolo caso, anche se in alcuni casi l’analisi degli AgNORs è di indubbio valore diagnostico, come nella distinzione tra nevi e melanomi, tra versamenti pleurici reattivi e neoplastici, tra fibromatosi e fibrosarcomi giovanili, e tra pielonefrite xantogranulomatosa e carcinomi renali. Noi abbiamo dimostrato una chiara differenza nel numero e distribuzione degli AgNORs tra nevo blu cellulare benigno e maligno. Ben presto emerse che l’analisi degli AgNORs aveva un forte potenziale prognostico. Dopo alcune osservazioni sul neuroblastoma infantile, studi su casistiche più ampie dimostrarono una chiara correlazione tra quantità di AgNORs e prognosi in carcinomi del grosso intestino. Da allora sono stati pubblicati 404 lavori sul significato prognostico degli AgNORs in tumori di ogni tipo istologico ed apparato. Nella maggior parte di essi è segnalata una correlazione tra elevata quantità di AgNORs e cattiva prognosi. Per più di 10 anni abbiamo studiato nel nostro laboratorio gli AgNORs in diversi tipi di neoplasie umane, e abbiamo potuto dimostrare un forte valore prognostico dell’analisi degli AgNORs in carcinomi della faringe, mielomi multipli, timomi, carcinomi della mammella maschile, carcinomi renali, carcinomi della prostata e in leucemie acute mieloidi dell’adulto. In tutte queste neoplasie, eccetto la leucemia mieloide acuta, l’analisi degli AgNORs appare come un fattore prognostico indipendente in analisi multivariata (3). Numerose sono le ragioni teoriche e sperimentali del valore prognostico degli AgNORs: esse sono sate discusse in ampie recensioni (4) e riassunte in una recente rassegna (3). Innanzi tutto, un aumento di AgNORs può dipendere da una aumentata richiesta di biogenesi ribosomale, il che riflette una elevata attività metabolica cellulare. Poi, essendo gli AgNORs localizzati nei cromosomi acrocentrici, un aumento di questi, che si può verificare in condizioni di aneuploidia, potrebbe tradursi in un aumento del numero di AgNORs. Noi abbiamo osservato una significativa associazione tra AgNORs e contenuto di DNA, valutato con citometria di flusso, in timomi, e in carcinomi vescicali e mammari maschili. Inoltre, è ben documentata l’associazione tra AgNORs e il grado di differenziazione istologica, uno dei classici parametri di prognosi tumorale. Questo è emerso anche in nostre ricerche nel mieloma multiplo, e in carcinomi vescicali, mammari maschili e prostatici. Soprattutto, la quantità di AgNORs riflette l’attività proliferativa cellulare. A conferma di molti lavori riportati in letteratura, noi abbiamo osservato una forte correlazione tra AgNORs ed indici di proliferazione, come il MIB-1 e PCNA in carcinomi mammari maschili, vescicali e faringei, e incorporazione di bromodesossisuridina nel mieloma multiplo. Tuttavia, la progressione neoplastica dipende, più che dall’attività proliferativa di per sé, dalla rapidità della proliferazione, ed è stato dimostrato che gli AgNORs sono strettamente correlati colla velocità di duplicazione cellulare. Infatti, la duplicazione cellulare richiede la sintesi di molte nuove proteine e quindi una attiva sintesi di RNA ribosomale, per la cui trascrizione sono necessarie le proteine AgNORs, soprattutto la nucleolina e la B23. Se il tempo di duplicazione cellulare è breve, la sintesi di RNA ribosomale in questo periodo deve essere necessariamente elevata, e grande è l’aumento di tutte le proteine nucleolari implicate nella trascrizione ed assemblaggio del RNA ribosomale. Pertanto un elevato numero di AgNORs indica che un tumore ha una elevata attività metabolica, ha probabilmente un contenuto anomalo di DNA, è verosimilmente poco differenziato, ha una elevata attività proliferativa ed una rapida crescita. Quindi una grande quantità di AgNORs è espressione di un fenotipo tumorale aggressivo. Oltre che informazioni sulla biologia tumorale, l’analisi degli AgNORs offre anche alcuni vantaggi di ordine pratico per il patologo. In primo luogo, può essere eseguita anche su biopsie molto piccole e difficilmente ripetibili, consentendo la contemporanea valutazione dell’attività proliferativa e dell’aspetto istologico, a differenza di altri metodi come la citometria di flusso che richiedono spesso l’esaurimento del materiale. Poi, permette di individuare nell’ambito di una neoplasia gruppi o foci di cellule con elevata attività proliferativa, localizzando cloni neoplastici particolarmente aggressivi. Inoltre, consente di valutare l’attività proliferativa delle sole cellule neoplastiche quando sono scarse e disperse tra altre cellule non tumorali altamente proliferanti, come nei timomi a prevalenza linfocitaria o nei mielomi interstiziali. Infine, combinando la valutazione della proliferazione e il grado di differenziazione istologica, permette al patologo di identificare gruppi di rischio morfo-funzionali. Proprio su queste basi, abbiamo potuto differenziare pazienti con mieloma, carcinomi della faringe, della mammella maschile e della prostata in gruppi di alto e basso rischio, che potrebbero beneficiare di diversi approcci terapeutici. Alcune perplessità ancora oggi ostacolano una diffusione più ampia dell’analisi degli AgNORs. Tra queste, una presunta indaginosità e, soprattutto, una scarsa riproducibilità del metodo. In realtà, esso non è più complesso di altre metodiche isto- e immunoistochimiche, e risultati riproducibili possono essere ottenuti ricorrendo all’analisi standardizzata (5), che prevede tempi e temperature di incubazione strettamente controllati e la misurazione dell’area degli AgNORs con analizzatore di immagine. Dal 1993, il Comitato Europeo per la Quantificazione degli AgNORs organizza incontri a scadenza annuale o biennale, per divulgare i risultati più recenti e proporre aggiornamenti e nuove applicazioni del metodo. E’ auspicabile che questa attività venga ulteriormente sviluppata inserendo questi incontri in apposite sessioni di Congressi scientifici nazionali ed internazionali. Bibliografia 1. Ploton D, Menager M, Jeannesson P, Himber G, Pigeon F, Adnet JJ. Improvement in the staining and in the visualisation of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level. Histochem J 18, 5-14, 1986. 2. Crocker J, Skilbeck N. Nucleolar organizer regions in melanocytic lesions: a quantitative study. J Clin Pathol 40, 885-889, 1987. 3. Pich A, Chiusa L, Margaria E. Prognostic relevance of AgNORs in tumor pathology. Micron 31, 133-141, 2000. 4. Derenzini M, Sirri V, Trerè D: Nucleolar organizer regions in tumor cells. Cancer J 7:71-77,1994. 5. Tuccari G, Giuffrè G, Öfner D, Rüschoff J. Standardized use of the AgNOR method. J Oral Pathol Med 29, 526-527, 2000.
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