Il Mesotelioma Pleurico Maligno (MPM) è una neoplasia estremamente aggressiva che origina dal mesotelio che riveste la superficie della cavità pleurica, normalmente a seguito di esposizione a fibre di amianto. Benché attualmente siano stati adottati provvedimenti molto severi per limitare l’esposizioni all’amianto, il periodo di latenza estremamente prolungato della malattia comporterà sicuramente un drammatico incremento dell’incidenza della patologia nei prossimi anni. Questa neoplasia è caratterizzata da un esito clinico normalmente infausto e la mediana della sopravvivenza risulta inferiore ad un anno. Il MPM è, infatti, estremamente resistente alla maggior parte dei trattamenti chemioterapici attualmente disponibili e la radioterapia è generalmente inefficace come trattamento primario. A causa, quindi, dell’estrema resistenza del MPM a tutti i farmaci attualmente disponibili e dell’aumento della sua incidenza, è evidente la necessità di sviluppare con urgenza nuovi trattamenti per questo tumore. Tra i farmaci più innovativi, gli Inibitori del Proteasoma (PI), si stanno sempre più rivelando degli agenti terapeutici indicati nei confronti di vari tipi di tumori che sono refrattari ai trattamenti attualmente disponibili. Uno di questi composti, il PS-341 induce un’apoptosi selettiva delle neoplasie ematologiche e dei tumori solidi, incluso il mieloma, il linfoma mantellare, i tumori del polmone non a piccole cellule, del colon, del sistema nervoso centrale, dell’ovaio, del pancreas, della prostata, della testa e del collo dell’utero. Il PS-341 è stato recentemente approvato come farmaco di prima linea per il trattamento del mieloma multiplo (MM) e promettenti risultati clinici iniziali sono stati riportati anche nel linfoma non-Hodgkin e in molti tumori solidi. Recenti studi volti ad analizzare il profilo generale del trascrittoma delle cellule del mesotelioma tramite DNA microarrays hanno permesso di identificare specifiche alterazioni della via degradativa proteasomale sia nel MPM (Roe OD et al. Lung Cancer 2009) che nel Mesotelioma Peritoneale (Borczuk AC et al. Oncogene 2007). Parallelamente, alcuni importanti studi hanno recentemente messo in evidenza come gli inibitori del proteasoma inducano apoptosi in linee cellulari di mesotelioma ma non di mesotelio normale (Gordon GJ Cancer Chem Pharmacol 2008; Sun X Cancer Lett. 2006; Sartore-Bianchi A Clin Cancer Research 2007; Borczuk AC Oncogene 2007; Yuan BZ Translational Onc, 2008). Sulla base di questi studi in vitro, il PS-341, sia da solo che in combinazione con il cisplatino, è attualmente in sperimentazione in due trials clinici europei. Nonostante questi risultati estremamente promettenti, l’esatto meccanismo molecolare responsabile della sensibilità delle cellule di questo tumore agli effetti pro-apoptotici degli inibitori del proteasoma così come le basi della sensibilità individuale sono ancora completamente ignoti. Nel corso di nostri precedenti studi abbiamo recentemente scoperto che uno squilibrio tra una ridotta attività proteasomale e un’accresciuta sintesi proteica è una caratteristica che predispone le plasmacellule sia normali che neoplastiche all’apotosi (Cenci S EMBO J 2006; Cascio P Eur J Immunol 2008, Bianchi G Blood 2009). Ne consegue, quindi, che è proprio la saturazione della capacità degradativa cellulare (condizione nota come Stress Proteasomale) che rende le cellule del MM, e verosimilmente di altre neoplasie, estremamente vulnerabili agli inibitori del proteasoma. Obiettivi. Con il presente progetto di ricerca ci proponiamo pertanto di stabilire se anche nel caso del MPM l’estrema sensibilità delle cellule neoplastiche all’azione pro-apoptotica degli inibitori del proteasoma sia dovuta ad una ridotta attività proteasomale con conseguente saturazione della capacità proteolitica cellulare e comparsa, quindi, di un tipico quadro di stress proteotossico. Ci prefiggiamo quindi di: • Valutare la capacità degradativa proteasomale in cellule di MPM e in cellule di mesotelio normale; • Evidenziare in cellule di MPM quadri di stress proteasomale; • Studiare il meccanismo che nelle cellule del MPM regola la capacità degradativa proteasomale e la sensibilità apoptotica agli inibitori del proteasoma; • Identificare eventuali strategie adattative impiegate dalle cellule tumorali per adattarsi allo stress proteasomale; • Disegnare strategie per manipolare lo stress proteasomale in modo da accentuare la sensibilità delle cellule del MPM all’azione pro-apoptotica dell’inibizione del proteasoma. Metodi. L’attività enzimatica e il carico degradativo del proteasoma verranno misurati in linee cellulari umane di MPM e di mesotelio normale mediante tecniche biochimiche (saggi enzimatici con peptidi fluorogenici) e di biologia cellulare e molecolare (pulse and chase e utilizzo di Ub-GFP) da noi già ampiamente utilizzate e i dati così ottenuti verranno correlati con la sensibilità apoptotica a diversi inibitori del proteasoma (PS-341, Epoxomicina, Lactacistina) misurata in vitro (tramite Facs). I livelli d’espressione del proteasoma e i quadri di stress proteasomale verranno valutati sia in estratti delle linee cellulari di MPM che in campioni di tumori maligni primitivi della pleura (provenienti dalla Divisione Universitaria di Chirurgia Toracica dell’Ospedale S. Giovanni Battista di Torino, Dr. P.L. Filosso, e dal reparto di Chirurgia Toracica dell’Ospedale Regionale di Aosta, Dr. G. Donati) mediante western blotting, immunofluorescenza e immunoistochimica con anticorpi specifici per le subunità proteasomali e per le proteine poli-ubiquitinate, il cui accumulo rappresenta un chiaro sintomo di stress proteasomale in atto. Successivamente manipoleremo i livelli proteasomali (mediante una tecnica da noi messa a punto basata sull’utilizzo di basse dosi di PI reversibili) e il carico degradativo (con diversi farmaci e condizioni che sono noti causare stress cellulare) e misureremo la sensibilità apoptotica agli inibitori del proteasoma per stabilire una correlazione causale tra la capacità proteasomale, il carico degradativo e la morte cellulare, in modo da identificare nuovi bersagli sfruttabili per ottenere l’eliminazione selettiva tramite apoptosi delle cellule del MPM. Risultati attesi e ricadute per il SSR. Il nostro progetto di ricerca si propone di: i) Identificare nuovi networks molecolari che collegano tra loro lo stress proteotossico e la morte cellulare nel MPM; ii) Identificare nuovi indicatori prognostici e bersagli molecolari nelle risposte apoptotiche e da stress; iii) Sviluppare nuovi saggi e test clinici; iv) Sviluppare nuove terapie più efficaci e meno tossiche contro il MPM; I nostri risultati potranno, quindi, generare terapie più potenti, più specifiche e adattate ad ogni singolo paziente con conseguenti migliori risposte cliniche e prolungata sopravvivenza nel MPM. Un ulteriore importante risultato clinico che potrebbe potenzialmente derivare dalla nostra ricerca è quello di evitare dannosi nonché costosi trattamenti farmacologici nei soggetti non rispondenti. Infine l’identificazione di nuovi bersagli molecolari potrà condurre a studi preclinici aventi lo scopo di sviluppare nuovi farmaci o nuove strategie terapeutiche contro il MPM.

Studio dei proteasomi come potenziali target molecolari di nuove terapie contro il Mesotelioma Pleurico Maligno

CASCIO, Paolo;MIOLETTI, Silvia;CERRUTI, Fulvia
2009

Abstract

Il Mesotelioma Pleurico Maligno (MPM) è una neoplasia estremamente aggressiva che origina dal mesotelio che riveste la superficie della cavità pleurica, normalmente a seguito di esposizione a fibre di amianto. Benché attualmente siano stati adottati provvedimenti molto severi per limitare l’esposizioni all’amianto, il periodo di latenza estremamente prolungato della malattia comporterà sicuramente un drammatico incremento dell’incidenza della patologia nei prossimi anni. Questa neoplasia è caratterizzata da un esito clinico normalmente infausto e la mediana della sopravvivenza risulta inferiore ad un anno. Il MPM è, infatti, estremamente resistente alla maggior parte dei trattamenti chemioterapici attualmente disponibili e la radioterapia è generalmente inefficace come trattamento primario. A causa, quindi, dell’estrema resistenza del MPM a tutti i farmaci attualmente disponibili e dell’aumento della sua incidenza, è evidente la necessità di sviluppare con urgenza nuovi trattamenti per questo tumore. Tra i farmaci più innovativi, gli Inibitori del Proteasoma (PI), si stanno sempre più rivelando degli agenti terapeutici indicati nei confronti di vari tipi di tumori che sono refrattari ai trattamenti attualmente disponibili. Uno di questi composti, il PS-341 induce un’apoptosi selettiva delle neoplasie ematologiche e dei tumori solidi, incluso il mieloma, il linfoma mantellare, i tumori del polmone non a piccole cellule, del colon, del sistema nervoso centrale, dell’ovaio, del pancreas, della prostata, della testa e del collo dell’utero. Il PS-341 è stato recentemente approvato come farmaco di prima linea per il trattamento del mieloma multiplo (MM) e promettenti risultati clinici iniziali sono stati riportati anche nel linfoma non-Hodgkin e in molti tumori solidi. Recenti studi volti ad analizzare il profilo generale del trascrittoma delle cellule del mesotelioma tramite DNA microarrays hanno permesso di identificare specifiche alterazioni della via degradativa proteasomale sia nel MPM (Roe OD et al. Lung Cancer 2009) che nel Mesotelioma Peritoneale (Borczuk AC et al. Oncogene 2007). Parallelamente, alcuni importanti studi hanno recentemente messo in evidenza come gli inibitori del proteasoma inducano apoptosi in linee cellulari di mesotelioma ma non di mesotelio normale (Gordon GJ Cancer Chem Pharmacol 2008; Sun X Cancer Lett. 2006; Sartore-Bianchi A Clin Cancer Research 2007; Borczuk AC Oncogene 2007; Yuan BZ Translational Onc, 2008). Sulla base di questi studi in vitro, il PS-341, sia da solo che in combinazione con il cisplatino, è attualmente in sperimentazione in due trials clinici europei. Nonostante questi risultati estremamente promettenti, l’esatto meccanismo molecolare responsabile della sensibilità delle cellule di questo tumore agli effetti pro-apoptotici degli inibitori del proteasoma così come le basi della sensibilità individuale sono ancora completamente ignoti. Nel corso di nostri precedenti studi abbiamo recentemente scoperto che uno squilibrio tra una ridotta attività proteasomale e un’accresciuta sintesi proteica è una caratteristica che predispone le plasmacellule sia normali che neoplastiche all’apotosi (Cenci S EMBO J 2006; Cascio P Eur J Immunol 2008, Bianchi G Blood 2009). Ne consegue, quindi, che è proprio la saturazione della capacità degradativa cellulare (condizione nota come Stress Proteasomale) che rende le cellule del MM, e verosimilmente di altre neoplasie, estremamente vulnerabili agli inibitori del proteasoma. Obiettivi. Con il presente progetto di ricerca ci proponiamo pertanto di stabilire se anche nel caso del MPM l’estrema sensibilità delle cellule neoplastiche all’azione pro-apoptotica degli inibitori del proteasoma sia dovuta ad una ridotta attività proteasomale con conseguente saturazione della capacità proteolitica cellulare e comparsa, quindi, di un tipico quadro di stress proteotossico. Ci prefiggiamo quindi di: • Valutare la capacità degradativa proteasomale in cellule di MPM e in cellule di mesotelio normale; • Evidenziare in cellule di MPM quadri di stress proteasomale; • Studiare il meccanismo che nelle cellule del MPM regola la capacità degradativa proteasomale e la sensibilità apoptotica agli inibitori del proteasoma; • Identificare eventuali strategie adattative impiegate dalle cellule tumorali per adattarsi allo stress proteasomale; • Disegnare strategie per manipolare lo stress proteasomale in modo da accentuare la sensibilità delle cellule del MPM all’azione pro-apoptotica dell’inibizione del proteasoma. Metodi. L’attività enzimatica e il carico degradativo del proteasoma verranno misurati in linee cellulari umane di MPM e di mesotelio normale mediante tecniche biochimiche (saggi enzimatici con peptidi fluorogenici) e di biologia cellulare e molecolare (pulse and chase e utilizzo di Ub-GFP) da noi già ampiamente utilizzate e i dati così ottenuti verranno correlati con la sensibilità apoptotica a diversi inibitori del proteasoma (PS-341, Epoxomicina, Lactacistina) misurata in vitro (tramite Facs). I livelli d’espressione del proteasoma e i quadri di stress proteasomale verranno valutati sia in estratti delle linee cellulari di MPM che in campioni di tumori maligni primitivi della pleura (provenienti dalla Divisione Universitaria di Chirurgia Toracica dell’Ospedale S. Giovanni Battista di Torino, Dr. P.L. Filosso, e dal reparto di Chirurgia Toracica dell’Ospedale Regionale di Aosta, Dr. G. Donati) mediante western blotting, immunofluorescenza e immunoistochimica con anticorpi specifici per le subunità proteasomali e per le proteine poli-ubiquitinate, il cui accumulo rappresenta un chiaro sintomo di stress proteasomale in atto. Successivamente manipoleremo i livelli proteasomali (mediante una tecnica da noi messa a punto basata sull’utilizzo di basse dosi di PI reversibili) e il carico degradativo (con diversi farmaci e condizioni che sono noti causare stress cellulare) e misureremo la sensibilità apoptotica agli inibitori del proteasoma per stabilire una correlazione causale tra la capacità proteasomale, il carico degradativo e la morte cellulare, in modo da identificare nuovi bersagli sfruttabili per ottenere l’eliminazione selettiva tramite apoptosi delle cellule del MPM. Risultati attesi e ricadute per il SSR. Il nostro progetto di ricerca si propone di: i) Identificare nuovi networks molecolari che collegano tra loro lo stress proteotossico e la morte cellulare nel MPM; ii) Identificare nuovi indicatori prognostici e bersagli molecolari nelle risposte apoptotiche e da stress; iii) Sviluppare nuovi saggi e test clinici; iv) Sviluppare nuove terapie più efficaci e meno tossiche contro il MPM; I nostri risultati potranno, quindi, generare terapie più potenti, più specifiche e adattate ad ogni singolo paziente con conseguenti migliori risposte cliniche e prolungata sopravvivenza nel MPM. Un ulteriore importante risultato clinico che potrebbe potenzialmente derivare dalla nostra ricerca è quello di evitare dannosi nonché costosi trattamenti farmacologici nei soggetti non rispondenti. Infine l’identificazione di nuovi bersagli molecolari potrà condurre a studi preclinici aventi lo scopo di sviluppare nuovi farmaci o nuove strategie terapeutiche contro il MPM.
P. Cascio; S. Mioletti; F. Cerruti
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