Introduzione Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) possiedono buone capacità differenziative e plastiche; classicamente esse sono ottenute dal midollo osseo, dal sangue periferico e dal cordone ombelicale. Proprio la possibilità di ottenere MSCs da tessuti di individui adulti e quindi favorirne la proliferazione ed il differenziamento in vitro, ne rende interessante l’utilizzo nei trapianti autologhi finalizzati al ripristino di tessuti gravemente danneggiati; seguendo questa strategia è possibile evitare il rischio di rigetto senza dover ricorrere all’utilizzo di cellule staminali di origine embrionale, con tutti i problemi etici che ne deriverebbero. Recentemente numerose pubblicazioni scientifiche hanno dimostrato come sia possibile ottenere MSCs anche da tessuti od organi non correlati con il sangue. Tra queste, una indubbiamente molto interessante, anche se sinora poco sfruttata, è rappresentata dalla polpa dentaria, da cui le MSCs potrebbero essere facilmente e rapidamente estratte. In stadi molto precoci dell’embriogenesi (nell’uomo 11° settimana), infatti, il mesenchima da cui originerà la futura polpa dentaria, è già “isolato” dall’ambiente circostante da una struttura fibrotica definita sacco mesenchimale. Esso è così in grado di proteggere le MSCs dagli eventuali stimoli differenziativi presenti nei tessuti limitrofi. Giacché nei roditori i denti incisivi sono caratterizzati da una crescita continua, con lo scopo di sopperire al loro consumo, è ipotizzabile che essi siano una fonte estremamente ricca di MSCs. Il nostro studio è stato quindi rivolto all’isolamento ed alla caratterizzazione di una linea di MSCs ricavata dalla polpa dentaria (MSCDPs) estratta da incisivi di ratto e dalla sua successiva stimolazione con vari agenti differenziativi per valutarne le capacità differenziative. Materiali e metodi Isolamento delle cellule staminali dalla polpa dentaria: Le MSCs sono state estratte da denti incisivi di ratti Sprague-Dawley di 5-6 mesi. La polpa dentaria è stata rimossa delicatamente dal forame apicale e quindi digerita in una soluzione 3 mg/ml di collagenasi di tipo I e 4 mg/ml di dispasi per 1h a 37°C. La sospensione cellulare ottenuta è stata quindi filtrata attraverso un setaccio (70µm) allo scopo di ottenere una coltura di MSCDPs (Gronthos S. et al., PNAS 2000) non contaminata con altri elementi cellulari. Successivamente esse sono state poste in coltura a 37°C e con il 5% di CO2, in RPMI-1640 supplementato con il 10% di siero fetale bovino (FCS), 100 U/ml di penicillina G, 40 µg/ml di gentamicina e 2,5 µg/ml di anfotericina B. Caratterizzazione delle MSCPDs: La linea cellulare ottenuta è stata inizialmente caratterizzata attraverso tecniche di microscopia ottica ed elettronica ed in seguito mediante tecniche di immunoistochimica abbinate alla microscopia confocale. Gli anticorpi utilizzati erano rivolti nei confronti di antigeni quali il c-KIT (CD117), il Thy-1 (CD90), il CD45 ed il CD34 (Raimondo et al., J. Anat 2006). Per valutare le capacità differenziative della linea isolata, le MSCDPs sono state trattate con stimoli specifici per l’induzione del differenziamento in adipociti, condroblasti ed osteoblasti. Al fine di ottenere una popolazione adipocitaria, le cellule sono state coltivate per 5 giorni con terreno completo a cui sono stati aggiunti 1µM di desametasone, 1,7µM di insulina e 0,5 mM di isobutilmetilxantina (IBMX). Per indurre il differenziamento verso la popolazione condroblastica, le MSCDPs sono state poste in coltura in terreno completo, in condizioni di sub-confluenza, per 3 settimane con l’aggiunta di 50 µg/ml di acido ascorbico, desametasone 0,1µM e 10 ng/ml diTGFβ3. Analogamente la differenziazione osteoblastica è stata ottenuta mediante la stimolazione con 100 µg/ml di acido ascorbico, desametasone 0,1µM e β-glicerofosfato 10 mM per 3 settimane. Le cellule sono quindi state raccolte ed analizzate sia con tecniche di istochimica (blu di toluidina e fosfatasi alcalina), al fine di evidenziare i marcatori specifici, sia con tecniche di microscopia elettronica, per mettere in evidenza eventuali aspetti morfologici caratteristici. Gli esperimenti sono stati condotti rispettivamente dopo uno e diciotto mesi dall’isolamento delle MSCDPs. Risultati Dopo un mese dall’isolamento la linea cellulare ha evidenziato al microscopio ottico una forma cellulare fibroblast-like, del tutto analoga a quella delle MSCs del midollo osseo: tuttavia, quando osservate in sospensione, le MSCDPs hanno mostrato un nucleo polilobato disposto eccentricamente. La microscopia elettronica ha evidenziato ulteriori aspetti morfologici: la membrana plasmatica delle MSCDPs è caratterizzata dalla presenza di numerosi microvilli e sottili estroflessioni, mentre i nuclei sono apparsi di forma irregolare con la presenza di più nucleoli ed importanti addensamenti cromatinici in posizione perinucleare; le MSCDPs presentano inoltre numerosi mitocondri, sia di forma allungata sia rotondeggiante. Il citosol appare molto ricco di ribosomi, sia associati al REG sia liberi. All’analisi immunoistologica le MSCDPs isolate si sono dimostrate positive per gli antigeni CD117 e CD90 (tipici dei progenitori multipotenti), mentre sono apparse negative per i marcatori di differenziamento linfocitario (CD45) ed ematopoietico (CD34). Quando sottoposte ad adeguati stimoli, le MSCDPs sono state in grado di differenziare in vari sensi: la stimolazione insulinica ha comportato la comparsa, osservabile al microscopio elettronico, di vescicole lipidiche citoplasmatiche. Il differenziamento delle MSCPDs in condroblasti è stata evidenziata tramite microscopia ottica colorando le cellule con blu di toluidina: i condroblasti, basofili, appaiono colorati intensamente di blu. Le MSCPDs stimolate assumono una più marcata colorazione ed il loro aspetto morfologico è più rotondeggiante, mentre le cellule appaiono raccolte in gruppi. La stimolazione verso il differenziamento osteoblastico ha portato le MSCDPs alla deposizione massiccia di sali di calcio, come evidenziato dalla colorazione con la fosfatasi alcalina: le cellule non trattate appaiono colorate con uno sfondo giallo, quelle stimolate presentano densi accumuli neri accoppiati alla morfologia più rotondeggiante. Attualmente, dopo circa 18 mesi di mantenimento in coltura (continua od alternata a periodi di crioconservazione) la linea cellulare ha mantenuto le stesse caratteristiche morfologiche, sia in microscopia ottica sia in quella elettronica, lo stesso profilo antigenico e l’inalterata capacità differenziativa originale. Conclusioni ed ulteriori sviluppi La linea cellulare da noi ottenuta esprime un profilo antigenico tipico dei progenitori mesenchimali ed ha dimostrato un’ottima stabilità fenotipica in coltura, a 18 mesi dal suo isolamento, possedendo nel contempo spiccate capacità differenziative quando stimolata in senso adipo-, condro- ed osteo-citario. Vista la relativa facilità di coltura della linea ottenuta, questi dati deporrebbero per un suo possibile utilizzo come modello sperimentale nell’ambito degli studi inerenti alle cellule staminali mesenchimali ottenute da tessuti di individui adulti. Inoltre, se essa dovesse dimostrare ulteriori capacità differenziative verso altri elemnti celluari, quali ad es. miocardiociti o cellule del SNC, l’interesse nelle MSCs residenti nella polpa dentaria potrebbe ulteriormente aumentare, vista la relativa facilità con la quale essa può essere prelevata.

Fenotipizzazione di una linea cellulare mesenchimale continua ottenuta da polpa dentaria

SPRIO, ANDREA ELIO;RAIMONDO, Stefania;SALAMONE, PAOLINA;DI SCIPIO, FEDERICA;RONCHI, GIULIA;BARBERIS, ALESSANDRO;PENNA, Claudia;PAGLIARO, Pasquale;GEUNA, Stefano;BERTA, Giovanni Nicolao;DI CARLO, Francesco
2008

Abstract

Introduzione Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) possiedono buone capacità differenziative e plastiche; classicamente esse sono ottenute dal midollo osseo, dal sangue periferico e dal cordone ombelicale. Proprio la possibilità di ottenere MSCs da tessuti di individui adulti e quindi favorirne la proliferazione ed il differenziamento in vitro, ne rende interessante l’utilizzo nei trapianti autologhi finalizzati al ripristino di tessuti gravemente danneggiati; seguendo questa strategia è possibile evitare il rischio di rigetto senza dover ricorrere all’utilizzo di cellule staminali di origine embrionale, con tutti i problemi etici che ne deriverebbero. Recentemente numerose pubblicazioni scientifiche hanno dimostrato come sia possibile ottenere MSCs anche da tessuti od organi non correlati con il sangue. Tra queste, una indubbiamente molto interessante, anche se sinora poco sfruttata, è rappresentata dalla polpa dentaria, da cui le MSCs potrebbero essere facilmente e rapidamente estratte. In stadi molto precoci dell’embriogenesi (nell’uomo 11° settimana), infatti, il mesenchima da cui originerà la futura polpa dentaria, è già “isolato” dall’ambiente circostante da una struttura fibrotica definita sacco mesenchimale. Esso è così in grado di proteggere le MSCs dagli eventuali stimoli differenziativi presenti nei tessuti limitrofi. Giacché nei roditori i denti incisivi sono caratterizzati da una crescita continua, con lo scopo di sopperire al loro consumo, è ipotizzabile che essi siano una fonte estremamente ricca di MSCs. Il nostro studio è stato quindi rivolto all’isolamento ed alla caratterizzazione di una linea di MSCs ricavata dalla polpa dentaria (MSCDPs) estratta da incisivi di ratto e dalla sua successiva stimolazione con vari agenti differenziativi per valutarne le capacità differenziative. Materiali e metodi Isolamento delle cellule staminali dalla polpa dentaria: Le MSCs sono state estratte da denti incisivi di ratti Sprague-Dawley di 5-6 mesi. La polpa dentaria è stata rimossa delicatamente dal forame apicale e quindi digerita in una soluzione 3 mg/ml di collagenasi di tipo I e 4 mg/ml di dispasi per 1h a 37°C. La sospensione cellulare ottenuta è stata quindi filtrata attraverso un setaccio (70µm) allo scopo di ottenere una coltura di MSCDPs (Gronthos S. et al., PNAS 2000) non contaminata con altri elementi cellulari. Successivamente esse sono state poste in coltura a 37°C e con il 5% di CO2, in RPMI-1640 supplementato con il 10% di siero fetale bovino (FCS), 100 U/ml di penicillina G, 40 µg/ml di gentamicina e 2,5 µg/ml di anfotericina B. Caratterizzazione delle MSCPDs: La linea cellulare ottenuta è stata inizialmente caratterizzata attraverso tecniche di microscopia ottica ed elettronica ed in seguito mediante tecniche di immunoistochimica abbinate alla microscopia confocale. Gli anticorpi utilizzati erano rivolti nei confronti di antigeni quali il c-KIT (CD117), il Thy-1 (CD90), il CD45 ed il CD34 (Raimondo et al., J. Anat 2006). Per valutare le capacità differenziative della linea isolata, le MSCDPs sono state trattate con stimoli specifici per l’induzione del differenziamento in adipociti, condroblasti ed osteoblasti. Al fine di ottenere una popolazione adipocitaria, le cellule sono state coltivate per 5 giorni con terreno completo a cui sono stati aggiunti 1µM di desametasone, 1,7µM di insulina e 0,5 mM di isobutilmetilxantina (IBMX). Per indurre il differenziamento verso la popolazione condroblastica, le MSCDPs sono state poste in coltura in terreno completo, in condizioni di sub-confluenza, per 3 settimane con l’aggiunta di 50 µg/ml di acido ascorbico, desametasone 0,1µM e 10 ng/ml diTGFβ3. Analogamente la differenziazione osteoblastica è stata ottenuta mediante la stimolazione con 100 µg/ml di acido ascorbico, desametasone 0,1µM e β-glicerofosfato 10 mM per 3 settimane. Le cellule sono quindi state raccolte ed analizzate sia con tecniche di istochimica (blu di toluidina e fosfatasi alcalina), al fine di evidenziare i marcatori specifici, sia con tecniche di microscopia elettronica, per mettere in evidenza eventuali aspetti morfologici caratteristici. Gli esperimenti sono stati condotti rispettivamente dopo uno e diciotto mesi dall’isolamento delle MSCDPs. Risultati Dopo un mese dall’isolamento la linea cellulare ha evidenziato al microscopio ottico una forma cellulare fibroblast-like, del tutto analoga a quella delle MSCs del midollo osseo: tuttavia, quando osservate in sospensione, le MSCDPs hanno mostrato un nucleo polilobato disposto eccentricamente. La microscopia elettronica ha evidenziato ulteriori aspetti morfologici: la membrana plasmatica delle MSCDPs è caratterizzata dalla presenza di numerosi microvilli e sottili estroflessioni, mentre i nuclei sono apparsi di forma irregolare con la presenza di più nucleoli ed importanti addensamenti cromatinici in posizione perinucleare; le MSCDPs presentano inoltre numerosi mitocondri, sia di forma allungata sia rotondeggiante. Il citosol appare molto ricco di ribosomi, sia associati al REG sia liberi. All’analisi immunoistologica le MSCDPs isolate si sono dimostrate positive per gli antigeni CD117 e CD90 (tipici dei progenitori multipotenti), mentre sono apparse negative per i marcatori di differenziamento linfocitario (CD45) ed ematopoietico (CD34). Quando sottoposte ad adeguati stimoli, le MSCDPs sono state in grado di differenziare in vari sensi: la stimolazione insulinica ha comportato la comparsa, osservabile al microscopio elettronico, di vescicole lipidiche citoplasmatiche. Il differenziamento delle MSCPDs in condroblasti è stata evidenziata tramite microscopia ottica colorando le cellule con blu di toluidina: i condroblasti, basofili, appaiono colorati intensamente di blu. Le MSCPDs stimolate assumono una più marcata colorazione ed il loro aspetto morfologico è più rotondeggiante, mentre le cellule appaiono raccolte in gruppi. La stimolazione verso il differenziamento osteoblastico ha portato le MSCDPs alla deposizione massiccia di sali di calcio, come evidenziato dalla colorazione con la fosfatasi alcalina: le cellule non trattate appaiono colorate con uno sfondo giallo, quelle stimolate presentano densi accumuli neri accoppiati alla morfologia più rotondeggiante. Attualmente, dopo circa 18 mesi di mantenimento in coltura (continua od alternata a periodi di crioconservazione) la linea cellulare ha mantenuto le stesse caratteristiche morfologiche, sia in microscopia ottica sia in quella elettronica, lo stesso profilo antigenico e l’inalterata capacità differenziativa originale. Conclusioni ed ulteriori sviluppi La linea cellulare da noi ottenuta esprime un profilo antigenico tipico dei progenitori mesenchimali ed ha dimostrato un’ottima stabilità fenotipica in coltura, a 18 mesi dal suo isolamento, possedendo nel contempo spiccate capacità differenziative quando stimolata in senso adipo-, condro- ed osteo-citario. Vista la relativa facilità di coltura della linea ottenuta, questi dati deporrebbero per un suo possibile utilizzo come modello sperimentale nell’ambito degli studi inerenti alle cellule staminali mesenchimali ottenute da tessuti di individui adulti. Inoltre, se essa dovesse dimostrare ulteriori capacità differenziative verso altri elemnti celluari, quali ad es. miocardiociti o cellule del SNC, l’interesse nelle MSCs residenti nella polpa dentaria potrebbe ulteriormente aumentare, vista la relativa facilità con la quale essa può essere prelevata.
V workshop delle unità operative Microsfere polimeriche e cellule staminali autologhe, nuovi studi sulle possibilità di rigenerazione del miocardio infartuato
Torino
4-5 novembre 2008
Atti del Congresso
Cooperativa Libraria Universitaria Editrice Bologna
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36
39
Sprio A E; Raimondo S; Salamone P; Di Scipio F; Marinos L M; Ronchi G; Barberis A; Penna C; Pagliaro P; Geuna S; Berta G N; Di Carlo F
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