Cixiidi vettori di fitoplasmi

I Cixiidi sono una famiglia di omotteri auchenorrinchi fulgoroidei, a distribuzione cosmopolita, che annovera a livello mondiale quasi 2000 specie ripartite in oltre 160 generi, mentre in Italia risulta rappresentata da 12 generi e 46 specie (D’Urso, 1995; Holzinger et al., 2003; Ceotto & Bourgoin, 2008). Emitteri di dimensioni medio-piccole, con adulti lunghi 3-11 mm caratterizzati da livree poco appariscenti bruno-grigie o nerastre e ali anteriori solitamente trasparenti, i cixiidi sono ritenuti uno dei taxa più primitivi fra i fulgoroidei, avendo mantenuto una serie di caratteri plesiomorfici, distintivi nell'ambito della superfamiglia, come la presenza di un terzo ocello sulla fronte degli adulti di molti generi. Lo sviluppo preimmaginale, tipicamente eterometabolico, passa attraverso cinque età postembrionali, solitamente distinte in due neanidali e tre ninfali e si realizza nel terreno a carico degli apparati radicali di un range generalmente esteso di piante ospiti. Le femmine e le forme giovanili di varie specie sono provviste all'estremità dell'addome di ghiandole esocrine, secernenti fiocchi e filamenti di candida cera bianca. Il primo accertamento di un'associazione fra cixiidi e fitoplasmi risale ai primi anni '80 quando fu verificata la capacità da parte di Myndus crudus Van Duzee di trasmettere a Cocos nucifera L. il “palm lethal yellowing” (Howard et al., 1983). È tuttavia con il riconoscimento della capacità da parte di Hyalesthes obsoletus Signoret di trasmettere alla vite il German grapevine yellows (Vergilbungskrankheit) (Maixner, 1994) che i cixiidi assumono a partire dalla metà degli anni '90 un'effettiva rilevanza economica come vettori di “agenti” di giallumi della vite. Nell'ultimo decennio, la presenza e diffusione di Legno nero (gruppo stolbur, sottogruppo 16SrXII-A) ha assunto proporzioni preoccupanti in varie regioni viticole europee, richiedendo peraltro specifici approfondimenti conoscitivi dei processi epidemiologici. In effetti, in diversi casi la diffusione epidemica della malattia implica il coinvolgimento di altri vettori oltre a H. obsoletus, risultando questo cixiide incapace di spiegare interamente il fenomeno, in quanto assente o a livelli demografici del tutto inconsistenti (Battle et al., 2000; Boudon-Padieu, 2000). Ciò ha spinto ad approfondire le indagini faunistiche e biomolecolari per l'individuazione, nei diversi comprensori viticoli, degli auchenorrinchi associati alle piante dell'agroecosistema e nel contempo ai fitoplasmi dello stolbur. Nel corso delle indagini condotte nell'ambito del progetto nazionale di ricerca “GIAVI”, varie popolazioni di Toya propinqua (Fieber) (Delphacidae), Dictyophara europaea (Dictyopharidae), Empoasca decipiens Paoli, Austroagallia sinuata (Mulsant & Rey), Psammotettix alienus (Dahlbom), Cicadella viridis (L.), Exitianus capicola (Stål), Thamnotettix zelleri (Kirschbaum), Anoplotettix putoni Ribaut e A. fuscovenosus (Ferrari) (Cicadellidae) sono risultate positive a fitoplasmi del sottogruppo 16SrXII-A (Bagnoli et al., 2005; Alma et al., 2008). Tuttavia, in considerazione dell'affinità biologica che sembrerebbe esistere fra cixiidi e fitoplasmi dello stolbur e che gli uni e gli altri presentano, almeno in termini generali, una notevole ampiezza del range delle loro piante ospiti (Marzachì et al., 2000; Holzinger et al., 2003; Carraro et al., 2008; Jović et al., 2009), le indagini sui possibili vettori dell' “agente” di Legno nero si sono andate sempre più focalizzando sulle specie dell'agroecosistema vigneto appartenenti alla stessa famiglia del vettore accertato. In Italia centrale, oltre a H. obsoletus, i cixiidi trovati ripetutamente positivi a fitoplasmi dello Stobur sono H. scotti Ferrari, H. luteipes Fieber e R. quinquecostatus (Dufour) (Trivellone et al., 2005; Alma et al., 2008). Per R. quinquecostatus, prove di laboratorio condotte utilizzando il metodo della membrana artificiale hanno consentito di accertare che maschi e femmine, naturalmente infetti da stolbur, sono in grado di inoculare il fitoplasma in un mezzo nutritivo artificiale, permettendo di definire la specie: “competente” a trasmettere i fitoplasmi dello stolbur (Pinzauti et al., 2008). Ciò, unitamente a una serie di caratteristiche bio-ecologiche rilevate negli adulti (mobilità nell'agroecosistema, ampelofilia, ampelofagia, elevato tasso d'infezione da 16SrXII-A), rende questo cixiide uno dei principali candidati a poter essere riconosciuto, a fianco di H. obsoletus, vettore dell' “agente” del Legno nero alla vite (Bagnoli et al., 2008). Tale designazione non può tuttavia prescindere da accurate prove di trasmissione su vite, peraltro già in corso da qualche anno. Nell’ambito del progetto “VIPLASMI” (Studi su fitoplasmi della vite e loro vettori: sensibilità varietale ed efficienza di acquisizione di Flavescenza dorata, diffusione e vettori di Legno nero, tecniche di riduzione del danno, 2007-2009), supportato finanziariamente dalla Regione Piemonte, sono state sviluppate indagini di campo e di laboratorio anche per l'approfondimento delle conoscenze sulla biodiversità della cixiidofauna presente nell’agroecosistema vigneto in Piemonte. Nel lavoro di questi tre anni sono state identificate, come entità d'interesse per i rapporti “cixiidi-stolbur-vite”, nove specie ripartite nei generi Cixius, Hyalesthes e Reptalus, gli ultimi due dei quali sembrano rivestire un'importanza decisamente superiore sia per il numero di specie comprese che per la densità di popolazione delle stesse, come pure per il legame che mostrano con molte delle piante spontanee generalmente presenti nell'agroecosistema vigneto, come ortica, convolvolo, artemisia, rovo, olmo, salice (Mazzoni, 2005; Picciau et al., 2008). In Piemonte gli adulti di H. obsoletus, H. luteipes, H. scotti, R. quinquecostatus e R. panzeri (Löw) sono solitamente presenti in una finestra temporale che va da metà giugno a fine agosto, mentre quelli di Reptalus cuspidatus (Fieber) emergono con un sensibile anticipo e si rinvengono da metà maggio a metà di luglio. Esami molecolari condotti su esemplari di popolazioni di tutte queste specie hanno permesso di confermare, o rilevare per la prima volta, come le stesse risultino con buona frequenza “positive” ai fitoplasmi dello stolbur e possiedano pertanto lo status di potenziali vettori del patogeno (Picciau et al., in preparazione). La caratterizzazione della cixiidofauna dell'agroecosistema vigneto, in termini bio-eco-etologici, demografici ed epidemiologici legati a Legno nero, trova nella corretta identificazione specifica delle varie popolazioni entomatiche un presupposto fondamentale. Come in molti altri taxa della classe degli insetti, le chiavi per la determinazione sistematica specifica si basano tuttora sui caratteri morfologici esterni degli adulti e più in particolare sulla morfologia dell'armatura genitale maschile: apparato differenziatosi in genere più di altre strutture e avente pertanto maggiore valore diagnostico. La mancanza di caratteri morfologici distintivi, a livello specifico, per lo stadio adulto femminile, gli stadi preimmaginali e le uova, limita la certezza della determinazione tassonomica soprattutto in presenza di popolazioni miste appartenenti a specie congeneri. L’analisi di sequenze geniche può fornire, anche per questo gruppo di auchenorrinchi, nuovi strumenti identificativi in grado di integrare e verificare l’approccio tassonomico tradizionale. Nel nostro caso, saggi di PCR e PCR-RFLP condotti su una porzione del gene mitocondriale codificante per la citocromo-ossidasi I (mtCOI) e sulla sequenza spaziatrice ribosomale ITS2, hanno permesso la discriminazione delle specie dei generi Hyalesthes e Reptalus più comuni e diffuse nei comprensori viticoli italiani: H. obsoletus, H. scotti, H. luteipes, R. quinquecostatus, R. cuspidatus, R. panzeri e Reptalus melanochaetus (Fieber). I saggi di identificazione molecolare sono stati validati su un ampio numero di individui raccolti su diverse piante ospiti in molte località italiane ed europee. La ripetibilità dei risultati ha confermato la specificità e l’attendibilità dei marcatori molecolari mtCOI e ITS2. L’identificazione specifica molecolare, applicabile indistintamente a maschi, femmine e giovani, consente di monitorare le popolazioni in esame durante tutto l’anno (Bertin et al., in press; Bertin et al., in preparazione).