La famiglia di insetti Cixiidae include specie economicamente importanti per il loro ruolo di vettori di fitoplasmi appartenenti al gruppo stolbur (Candidatus Phytoplasma solani, gruppo 16SrXII-A). Hyalesthes obsoletus Signoret trasmette il fitoplasma associato al giallume della vite noto come Legno Nero (LN) (Maixner, 2006), mentre Reptalus panzeri Löw è il vettore di una fitopatia del mais nota come arrossamento del mais (Jović et al., 2007). Sebbene H. obsoletus sia l’unico vettore accertato di LN, altre specie di cixiidi potrebbero essere coinvolte nella trasmissione di questa fitoplasmosi. Infatti, le specie R. panzeri and H. luteipes Fieber sono state trovate positive al LN e R. quinquecostatus Dufour è in grado di inoculare il fitoplasma in mezzo artificiale (Palermo et al., 2004; Trivellone et al., 2005; Pinzauti et al., 2008). Ad oggi, l’identificazione delle specie di cixiidi è riservata a pochi entomologi esperti ad è basata sulla morfologia dell’armatura genitale maschile, impedendo di fatto il riconoscimento degli stadi giovanili e delle femmine. Metodi molecolari basati sull’analisi del DNA possono essere di supporto ai tradizionali strumenti tassonomici. Il nostro lavoro descrive l’efficacia delle regioni geniche mitocondriali e ribosomali nell’identificazione di alcune specie appartenenti ai generi Hyalesthes e Reptalus. Saggi di PCR-RFLP eseguiti con l’enzima di restrizione AluI sul gene mitocondriale codificante per la subunità 1 della citocromo ossidasi (COI) hanno prodotto profili specie-specifici per quattro specie del genere Reptalus: R. quinquecostatus, R. cuspidatus Fieber, R. panzeri e R. melanochaetus Fieber. L’amplificazione della regione ribosomale spaziatrice ITS2 fornisce frammenti di dimensione specifica per R. quinquecostatus e R. melanochaetus e un’ulteriore digestione enzimatica dei prodotti di PCR con TaqI consente di discriminare tra R. cuspidatus e R. panzeri. Analogamente, tre specie di Hyalesthes, H. obsoletus, H. luteipes e H. scotti Ferrari, possono essere identificate grazie al polimorfismo di dimensione dei frammenti di PCR della regione ITS2. Alternativamente, le tre specie possono essere identificate mediante un saggio di PCR-RFLP eseguito con TaqI sul gene COI. La ripetibilità dei marcatori ribosomali e mitocondriali è stata convalidata su un ampio numero di campioni raccolti su diverse piante ospiti e provenienti da diverse aree geografiche dell’Italia e dell’Est Europa. Entrambe le chiavi di identificazione molecolare sono risultate attendibili e forniscono un rapido strumento identificativo che può contribuire ad allargare la ristretta cerchia di entomologi specializzati nel riconoscimento dei cixiidi. Inoltre, questi marcatori possono essere applicati con successo agli stadi giovanili, privi di tratti morfologici distintivi, consentendo di ampliare il periodo di monitoraggio degli insetti vettori e permettendo l’inequivocabile associazione di ciascuna specie con l’effettiva pianta ospite. Le nuove chiavi molecolari potranno pertanto facilitare l’attività di monitoraggio dei potenziali vettori di stolbur. Per quanto riguarda H. obsoletus, le sequenze ITS2 e COI sono state analizzate anche a livello intra-specifico. Entrambi i marcatori hanno confermato un elevato grado di conservazione genetica all’interno della specie, poichè popolazioni provenienti da diverse regioni geografiche e raccolte su diverse piante ospiti non hanno rivelato alcun polimorfismo.

Identificazione molecolare di cixiidi vettori, accertati e potenziali, del fitoplasma associato al Legno Nero della vite

BERTIN, SABRINA;PICCIAU, Luca;ALMA, Alberto;BOSCO, Domenico
2010

Abstract

La famiglia di insetti Cixiidae include specie economicamente importanti per il loro ruolo di vettori di fitoplasmi appartenenti al gruppo stolbur (Candidatus Phytoplasma solani, gruppo 16SrXII-A). Hyalesthes obsoletus Signoret trasmette il fitoplasma associato al giallume della vite noto come Legno Nero (LN) (Maixner, 2006), mentre Reptalus panzeri Löw è il vettore di una fitopatia del mais nota come arrossamento del mais (Jović et al., 2007). Sebbene H. obsoletus sia l’unico vettore accertato di LN, altre specie di cixiidi potrebbero essere coinvolte nella trasmissione di questa fitoplasmosi. Infatti, le specie R. panzeri and H. luteipes Fieber sono state trovate positive al LN e R. quinquecostatus Dufour è in grado di inoculare il fitoplasma in mezzo artificiale (Palermo et al., 2004; Trivellone et al., 2005; Pinzauti et al., 2008). Ad oggi, l’identificazione delle specie di cixiidi è riservata a pochi entomologi esperti ad è basata sulla morfologia dell’armatura genitale maschile, impedendo di fatto il riconoscimento degli stadi giovanili e delle femmine. Metodi molecolari basati sull’analisi del DNA possono essere di supporto ai tradizionali strumenti tassonomici. Il nostro lavoro descrive l’efficacia delle regioni geniche mitocondriali e ribosomali nell’identificazione di alcune specie appartenenti ai generi Hyalesthes e Reptalus. Saggi di PCR-RFLP eseguiti con l’enzima di restrizione AluI sul gene mitocondriale codificante per la subunità 1 della citocromo ossidasi (COI) hanno prodotto profili specie-specifici per quattro specie del genere Reptalus: R. quinquecostatus, R. cuspidatus Fieber, R. panzeri e R. melanochaetus Fieber. L’amplificazione della regione ribosomale spaziatrice ITS2 fornisce frammenti di dimensione specifica per R. quinquecostatus e R. melanochaetus e un’ulteriore digestione enzimatica dei prodotti di PCR con TaqI consente di discriminare tra R. cuspidatus e R. panzeri. Analogamente, tre specie di Hyalesthes, H. obsoletus, H. luteipes e H. scotti Ferrari, possono essere identificate grazie al polimorfismo di dimensione dei frammenti di PCR della regione ITS2. Alternativamente, le tre specie possono essere identificate mediante un saggio di PCR-RFLP eseguito con TaqI sul gene COI. La ripetibilità dei marcatori ribosomali e mitocondriali è stata convalidata su un ampio numero di campioni raccolti su diverse piante ospiti e provenienti da diverse aree geografiche dell’Italia e dell’Est Europa. Entrambe le chiavi di identificazione molecolare sono risultate attendibili e forniscono un rapido strumento identificativo che può contribuire ad allargare la ristretta cerchia di entomologi specializzati nel riconoscimento dei cixiidi. Inoltre, questi marcatori possono essere applicati con successo agli stadi giovanili, privi di tratti morfologici distintivi, consentendo di ampliare il periodo di monitoraggio degli insetti vettori e permettendo l’inequivocabile associazione di ciascuna specie con l’effettiva pianta ospite. Le nuove chiavi molecolari potranno pertanto facilitare l’attività di monitoraggio dei potenziali vettori di stolbur. Per quanto riguarda H. obsoletus, le sequenze ITS2 e COI sono state analizzate anche a livello intra-specifico. Entrambi i marcatori hanno confermato un elevato grado di conservazione genetica all’interno della specie, poichè popolazioni provenienti da diverse regioni geografiche e raccolte su diverse piante ospiti non hanno rivelato alcun polimorfismo.
5° Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi
Ancona, Italia
21-23 settembre 2010
20(3)
728
730
Hyalesthes; Identificazione specifica; ITS2; mtCOI; Reptalus
Bertin S.; Picciau L.; Acs Z.; Alma A.; Bosco D.
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