Studio dei meccanismi patogenetici dell’Atassia Spinocerebellare 28.

L’atassia spinocerebellare tipo 28 ( SCA28 ) è una patologia autosomica dominante caratterizzata da atassia cerebellare lentamente progressiva e difetti oculomotori. Il gene mutato è AFG3L2 ( 18p11.21 ) , codificante per la proteina omonima che forma assieme a paraplegina il complesso esamerico m-AAA proteasi ( ATPases Associated with a variety of cellular Activities ) nella membrana mitocondriale interna ( IMM ) . Con un’analisi di espressione Genome-Wide, effettuata in collaborazione col gruppo del Dott. Gustincich, sono stati confrontati gli RNA estratti da linee linfoblastoidi ( LCL) di quattro pazienti SCA28 ( G671R, T654I, M666T e M666V ) e sei controlli sani ( assortiti per sesso ed età ) . I dati ottenuti hanno evidenziato 117 geni differenzialmente espressi nei pazienti rispetto ai controlli che sono stati raggruppati in cluster omogenei sulla base della loro funzione con l’aiuto dei software Gene Ontology e NCBI: sono risultati alterati i pathways coinvolti nella ( 1 ) crescita e metabolismo cellulare; ( 2 ) apoptosi; ( 3 ) risposta agli stress ossidativi. L’implicazione dei pathways è stata confermata con esperimenti funzionali sulle linee cellulari linfoblastoidi di sette pazienti e altrettanti controlli sani. 1. La velocità di proliferazione cellulare ( misurata con il test MTT ai tempi 0, 3 ore, 24 ore e 48 ore ) , delle linee LCL dei pazienti SCA28 è minore rispetto ai controlli sani ( p<0,001 ) . 2. L’analisi del ciclo cellulare ha evidenziato un incremento ( >15% ) rispetto ai controlli della percentuale di cellule ferme in fase G0/G1 nelle linee dei pazienti ( p<0,001 ) . 3. Le linee SCA28 dimostrano un aumentata mortalità cellulare ( misurazione al FACS con doppia colorazione AnnexinV/Propidio Ioduro ) : solo il 40% delle cellule SCA28 risulta vitale mentre nei controlli la vitalità è del 60% ( p<0,005 ) . 4. La quantificazione della Malonildialdeide ( MDA ) attraverso il saggio dell'acido tiobarbiturico ( TBA ) ha dimostrato che le linee SCA28 hanno livelli di perossidazione lipidica aumentati del 50% rispetto alle linee di controlli sani, in condizioni basali ( p<0.05 ) . In conclusione, l’analisi di espressione Genome Wide seppure effettuata sulle linee linfoblastoidi dei pazienti SCA28, un tessuto non direttamente colpito dalla patologia, ha permesso l’identificazione di tre pathways che sembrano essere correlati con la malattia. La diminuzione della crescita e proliferazione cellulare, l’aumento della mortalità e l’incremento dei livelli di stress ossidativo dimostrati nelle linee dei pazienti potrebbero spiegare in parte la patogenesi della SCA28. In parallelo è stato generato ( in collaborazione con il gruppo della Prof.ssa Turco ) il modello murino knockin di SCA28, in cui è stata inserita una delle mutazioni nel gene AFG3L2 presenti nell’uomo ( codificata come c.1997T>G o p.Met666Arg, nel topo M665R ) . Abbiamo scelto questa particolare mutazione perché presente nel paziente con il quadro clinico più grave. Al momento è nata la quinta generazione di backcrossing e sono iniziati i test motori per la caratterizzazione del fenotipo ( in collaborazione con il gruppo del Prof. Tempia) .